1949年，担任中国人民解放军济南市职工学校文化干事。1950年，先后担任济南警备政治部文工团、步兵九十七师文工队、山东军区政治部文工团演员。1955年，担任山东省话剧团的演员。
1959年，参演个人首部电影《敢想敢做的人》。1964年，与郭殿昌等共同主演剧情电影《丰收之后》。1978年，出演由傅超武、高正联合执导的剧情电影《平鹰坟》。
1981年，与王书勤、温玉娟联袂主演喜剧电影《喜盈门》，在片中饰演性格贤惠善良、慈祥的仁文妈妈，她凭借该片入围第2届中国电影金鸡奖最佳女配角奖。1982年，与倪萍等联合出演剧情电影《山菊花》。1983年，与高保成共同主演剧情电影《内当家》。
1984年，与吕晓禾、唐国强联合出演剧情电影《高山下的花环》，她凭借该片获得第8届电影百花奖最佳女配角奖、第4届中国电视剧飞天奖最佳女配角奖；同年，在传记电影《谭嗣同》中饰演慈禧太后，她凭借该片获得第5届中国电影金鸡奖最佳女配角奖；此外，还参演了剧情电影《欧妹》。1987年，王玉梅获得新时期十年电影演员荣誉奖。
1989年，由其出演的剧情电影《一代枪王》上映。1991年，与朱旭、费洋联合主演剧情电影《心香》，她凭借该片入围第12届中国电影金鸡奖最佳女配角奖。1992年，与赵秀丽合作主演的电视剧《帅大姐》播出。1994年，与高明俊、王馥荔联袂出演剧情电影《五魁》。1995年，与剧雪、常戎联合主演剧情电影《童年的风筝》。
1996年，与奇梦石、奚美娟联袂主演家庭伦理剧《儿女情长》，在剧中饰演外表慈祥内心善良的母亲方秀云，她凭借该剧获得第15届中国电视金鹰奖最佳女主角奖、第18届中国电视剧飞天奖优秀女演员奖。1997年，与王星军共同主演剧情电影《丝绸之路》；同年，与奥登高娃等联合主演传记电影《张骞》。
1999年，与薛佳凝合作主演剧情电影《人见人爱》。2000年，与田成仁、何冰联合主演剧情电影《金婚》。2001年，与王兰合作主演剧情电影《情归天尽头》。2003年，与赵静共同主演电视剧《撑起生命的蓝天》，该剧以中国首届“十大杰出母亲”沈利萍和其子王嘉鹏的真实故事改编。
2008年，与杨立新合作主演古装剧《漕运码头》，在剧中饰演爱新觉罗·铁麟的奶妈孙嬷嬷。2009年，在周晓文执导的家庭剧《晚婚》中饰演王秀英；同年，与王雅捷联合出演青春励志电影《舞蹈系》，在片中饰演老年时期的福才家；此外，还参演了古装剧《新包青天之七侠五义》。
2012年，与孙勇波共同主演戏曲电影《槐花几时开》。
