八千草薫于1931年生于日本大阪市的一个职员家庭，1946年进入宝冢音乐学校，次年进入宝冢歌剧团。1951年演出的《文福茶釜》等剧颇受好评，成为引人注目的人物，同年初次参演《宝冢夫人》一片，1954年连续主演稻恒浩导演的《宫本武藏》（共三部），被认为是很有希望的演员。
1955年在日本和意大利合拍的电影《蝴蝶夫人》中扮演女主人公，其出色的演技和优美的歌声使她名噪一时。继又参演《乱菊物语》、《白夫人的妖恋》（根据中国民间故事白蛇传改编）等片，以纯情可爱的少女形象为人所赏。1957年与岸惠子合演丰田四郎导演的《雪国》，在片中扮演叶子一角，颇有好评。同年退出宝冢歌剧团。与比她大17岁的电影导演谷口千吉结婚。
1960年与东宝株式会社演剧部签订专属契约，在拍摄电影和电视的同时参演舞台剧，继又参演《新·夫妇善哉》（1963）、《你好·小孩》（1964）、《奸细·伊贺住宅》（1965）等片。1965年，因在《美丽与悲哀》一片中的演技获得第12届亚洲电影节最佳女配角奖。1972年，被选拔为山田洋次导演的著名系列片《男人辛苦·寅次郎梦境》（第10级）中的女主人公。继而又演出寺山修司导演的《在田园中死去》（1974），山本萨夫导演的《不毛地带》（1976）等片，均有好评，其所塑造的银幕形象，大都为善良贤惠的女性，一直保持着纯情的特点，故使许多观众为之倾倒。
中年以后，八千草被誉为“理想的母亲形象”，另曾在电视连续剧《血疑》中扮演大岛敏江一角，故为中国观众非常熟悉，生活中的八千草熏与她扮演的角色一样朴实勤奋，无子。
2015年10月21日，出演由小田切让和尾野真千子主演的电视剧《点心之家》播出。
